一、操作流程：
（一）工作液體配制：
1）Fluo-4工作液配制：
每管Fluo-4 AM：+8μlDMSO +2μlF-127
2）Fluo-4工作液使用（0.5-5uM）
儲液稀釋1000倍使用（倍稀釋數(shù)可根據(jù)實驗調(diào)節(jié)）：1mlDMEM+1μlFluo-4工作液
3）Fluo-4指示劑孵育：
將培養(yǎng)皿中原培養(yǎng)基棄去,，加入500-1000μlFluo-4溶液,，37℃孵育20min,。
4）清洗：
將Fluo-4溶液棄去,，用不含有鈣,、鎂離子的HBSS溶液清洗3遍,，每次2-3min,，最后加上相應(yīng)的浴液開始拍攝,。
（二）鈣離子成像：
將待測樣品放在顯微鏡載物臺上觀察，通過鈣離子檢測系統(tǒng)進(jìn)行實時監(jiān)測測定,。在相同的環(huán)境下（同一光學(xué)系統(tǒng),、同一溫度、恒定的曝光時間等） 激發(fā)成像,，測定一定時間序列胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度Ratio 和鈣離子濃度的變化,。 使用普通熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。
以Leica MI8為例：
采用xyt時間軸拍攝模式：Time interval：3s,；Frames：200（根據(jù)實驗而定）,。
1） 開機(jī)：先開硬件,，再開軟件。
開機(jī)順序：按照顯微鏡電源,，LED熒光電源,，攝像機(jī)電源，電腦電源,，依次打開,。
2）啟動徠卡LAS X軟件
! 注意!
請不要在顯微鏡等相關(guān)硬件沒有開啟的情況下啟動軟件！
（1） 雙擊電腦桌面上LAS X圖標(biāo)啟動LAS X,。
徠卡LAS X 系統(tǒng)開始運行,。
使用徠卡LAS X進(jìn)行圖像采集時參數(shù)的設(shè)置方法。
點擊Acquire箭形圖標(biāo)后再點擊Acquisition,，就可以在Acquisition mode菜單中進(jìn)行設(shè)置了：
x和y按鈕總是處于激活狀態(tài),。
激活z按鈕即可進(jìn)行三維圖像采集的設(shè)置。（鈣成像不需對z進(jìn)行設(shè)置,，勿動,。）
激活t按鈕即可打開t-菜單，進(jìn)行時間序列采圖的條件設(shè)置,。
（3）光路設(shè)置
光路設(shè)置菜單位于LAS X界面的左邊,。通過該菜單可以對不同實驗進(jìn)行光路設(shè)置。
當(dāng)
圖標(biāo)處于激活狀態(tài),，就可以開始進(jìn)行光路設(shè)置了,。從第一個通道開始：
雙擊
，從LUT (色彩查找表)中選擇對應(yīng)的顏色
從反差方式（Contrast Method）窗口選擇您需要的對比方式,。在熒光濾色塊窗口選擇需要的熒光濾色塊,。
其他通道可以通過點擊"+" 按鈕來創(chuàng)建，也可以點擊"-"按鈕刪除不需要的通道,。如果想要改變通道的順序,，可以點擊對應(yīng)通道右鍵選擇移動（以 FCr 1為例）。
您可以自由定義多達(dá)8個通道,。且可以點擊右鍵保存您選擇的通道的設(shè)置,。保存的通道在以后的實驗還可以調(diào)用。
所有通道的組合包括采集參數(shù)都可以通過Load/Save Settings菜單來保存并可以從中調(diào)用已保存設(shè)置,。
(4)Image菜單
Image菜單用來設(shè)置攝像頭相關(guān)參數(shù)：
最重要的參數(shù)是Binning和Exposure曝光時間,。
Binning 是將幾個像素加起來作為一個像素讀出以提高靈敏度。比如Binning 2x2就是4個像素聯(lián)合起來 (x方向2個像素*y方向2個像素),。
這會使圖像分辨率降低4倍,。一般采圖會選擇Binning 2。
Exposure 曝光時間滑塊可以對每個通道的曝光時間分別設(shè)置,。Gain設(shè)置攝像頭的電子增益,。
Intensity 為照明光路的光強(qiáng)設(shè)置,。
（5）t-菜單 時間序列采圖
點擊，t-菜單即被激活,，可進(jìn)行時間序列圖像采集的設(shè)置:
選擇Cycle則可定義所需的圖像采集幀數(shù),。
選擇Duration，可定義采圖總時間,。
選擇Acquire until Stopped 則實驗沒有明確的結(jié)束時間,，圖像將持續(xù)采集直至點擊stop來終止。
Time Interval（采集相鄰兩幀圖像的時間間隔）可以在輸入框中定義（定義的時間間隔大于Minimize值）,。
如果Minimize被激活了,，則圖像采集時會按照最短時間間隔來執(zhí)行。
（三）,、數(shù)據(jù)圖像處理
1）保存軟件生成的LIF文件,。（非常重要）
2） 在電腦上成像后，建立背景 ROI,，計算背景光密度值 Fb 以扣除背景,。
3） 通過軟件自動識別細(xì)胞樣品，建立樣品 ROI 區(qū)域,。
4）實時輸出細(xì)胞的熒光光密度比率變化曲線圖和游離 Ca2+的濃度變化曲線圖 ,，并存儲數(shù)據(jù)。
（四）,、關(guān)機(jī)
關(guān)機(jī)時先關(guān)閉軟件再關(guān)閉，與開機(jī)時順序相反,。
二,、注意事項：
1、該儀器應(yīng)避免灰塵,、潮濕,、過冷、過熱（要求：環(huán)境溫度10-36℃,，濕度≤70%）及酸,、堿性蒸汽等；
2,、室內(nèi)不允許存放化學(xué)藥品,，更不得將鏡頭存放在裝有化學(xué)藥品的容器內(nèi)；
3,、分析完畢,，清理現(xiàn)場。顯微鏡的物鏡及目鏡光學(xué)表面可以使用棉簽蘸取無水乙醇清潔,。
4,、在放置培養(yǎng)板時,，輕拿輕放，避免液體濺落在鏡頭上,，萬一濺落請立即擦拭干凈,！
5、使用的給藥灌流裝置,，在實驗結(jié)束后必須使用過濾過的純水進(jìn)行沖洗?。〔坏蒙儆?/span>3遍,！
